Secuenciación en un instante

El 6 de febrero de 2007, ejecutivos de 454 Life Sciences le mostraron a James Watson, de 78 años, un primer borrador de su propio genoma. Había algo francamente poético en esto. Watson, por supuesto, había ganado un premio Nobel 45 años antes por su papel en el descubrimiento de la estructura de doble hélice del ADN; También fue uno de los principales impulsores del Proyecto Genoma Humano, que para su finalización en 2003 había gastado casi $ 3 mil millones durante 13 años extrayendo el plano que codifican esas hélices. Ahora 454 había dado un paso más allá de ese megaproyecto, que reunió el ADN de muchas personas para determinar la secuencia genética de lo que equivale a un modelo humano. La empresa y su llamada máquina de secuenciación de próxima generación habían leído por sí solos el código genético de un individuo, uno cuyo trabajo había hecho tanto para hacer posible el logro.

Jonathan Rothberg, de 454, cree que sus máquinas harán que la secuenciación sea tan barata y rápida que resultará práctico leer los genomas de los individuos.

Pero Jonathan Rothberg, quien fundó 454 en Branford, CT, con el sueño de producir una máquina secuenciadora más eficiente que las disponibles para el Proyecto Genoma Humano, no menciona poesía cuando relata su encuentro con Watson. Más bien, habla de dinero, velocidad y un futuro en el que la gente común lleva consigo sus genomas personales en discos, un escenario cada vez más plausible. Nos costó 200.000 dólares hacer a Jim Watson, señala Rothberg. Y lo hicimos principalmente en diciembre y enero.

Esta historia fue parte de nuestro número de mayo de 2007

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Rothberg, quien ahora preside la junta directiva de 454, enfatiza que el Proyecto Jim sigue siendo un trabajo en progreso y requerirá más tiempo y dinero. Hasta febrero, la empresa había secuenciado el ADN de Watson solo tres veces (cada ejecución aumentaba la precisión y llenaba los vacíos); Se requirieron nueve pases para producir la secuencia del borrador final del Proyecto Genoma Humano. Pero aún.

La empresa de Rothberg es solo una de varias, incluidas Illumina de San Diego y Applied Biosystems de Foster City, CA, que desarrollan máquinas que pueden decodificar el ADN más rápido que nunca. Y así como el costo de la energía de las computadoras se ha desplomado con la densidad en constante aumento de los transistores en los chips, el precio de secuenciar el ADN ha caído rápidamente con la llegada de estas máquinas. Hoy en día, el precio de un genoma humano decodificado con secuenciadores del tipo utilizado en el Proyecto Genoma Humano sería de 25 a 50 millones de dólares. Se reduce a alrededor de $ 1 millón con las máquinas de próxima generación disponibles en la actualidad y podría ser tan bajo como $ 100,000 en 2008.

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Como ha demostrado la historia de las computadoras, una mayor potencia de procesamiento por menos dinero puede dar lugar a aplicaciones imprevistas. A raíz del Proyecto Genoma Humano, los investigadores enfrentaron decisiones financieras difíciles sobre qué genomas secuenciar a continuación: chimpancé o macaco, vaca o delfín, arroz o mandioca. Las nuevas máquinas permiten secuenciar casi todo lo que interesa. Y a medida que fluyen cada vez más datos de secuencia a las bases de datos, se abren áreas de investigación completamente nuevas. Los científicos ahora tienen una capacidad sin precedentes para hacer comparaciones entre especies, arrojando luz sobre todo, desde cuestiones evolutivas hasta razones genéticas de las diferencias individuales en la resistencia y susceptibilidad a las enfermedades. La investigación realizada con las máquinas de 454 y publicada en las principales revistas incluye la secuenciación parcial de un genoma neandertal y el desarrollo de nuevas pruebas para mutaciones genéticas que causan cáncer, tecnología que puede ayudar a los médicos a adaptar los tratamientos a sus pacientes.

El último año ha sido el período más emocionante en genómica desde los días del Proyecto Genoma Humano, dice Eric Lander, primer autor del primer borrador publicado del genoma humano del proyecto y ahora director del Instituto Broad de Medicina Genómica en Cambridge, MA. . La secuenciación se está volviendo lo suficientemente barata y poderosa como para que pueda aplicarse a cualquier problema. Está poniendo el campo de cabeza. Francis Collins, quien dirigió el Proyecto Genoma Humano para los Institutos Nacionales de Salud, predice que las nuevas tecnologías de secuenciación tendrán profundas consecuencias para el futuro de la investigación biomédica y, en última instancia, para la práctica de la medicina.

Una solución única
La oficina de Jonathan Rothberg tiene un tema de comedor, con un piso de baldosas de tablero de ajedrez rojo y negro, sillas cromadas cubiertas de Naugahyde rojo y un sofá con brazos que imitan la parte trasera de un Cadillac de 1959, completo con aletas traseras monstruosas y luces traseras en forma de bala . En lugar de un escritorio, tiene un bar comedor con taburetes. Botellas de vino de un viñedo de Connecticut que posee se alinean en algunos de los estantes. Más allá de las ventanas se encuentra Long Island Sound. El lugar grita Soy único . Y así es Rothberg. En 1991, mientras completaba su doctorado en biología en la Universidad de Yale, fundó CuraGen, una de las primeras empresas en desarrollar fármacos basados ​​en la genómica. Además de CuraGen y 454 Life Sciences, ha fundado un instituto para el estudio de enfermedades infantiles y otra empresa de biotecnología, RainDance Technologies, que ha desarrollado lo que llama placas de circuito líquido que están diseñadas para hacer experimentos más eficientes manipulando pequeñas cantidades. de fluido. Y todo eso a los 43 años.

De hecho, fue el interés en la singularidad de cada persona lo que finalmente lo llevó a intentar diseñar un secuenciador que espera que algún día haga que los controles del genoma sean tan rutinarios como lo son ahora los análisis de sangre. Rothberg sostiene las entrañas de la máquina 454, un portaobjetos de vidrio con 1,6 millones de pozos en miniatura, cada uno de aproximadamente 50 micrómetros de ancho (aproximadamente la mitad del ancho de un cabello humano) y 55 micrómetros de profundidad. Es este chip el que permite a la máquina secuenciar el ADN tan rápidamente, porque se puede llevar a cabo una reacción química separada en cada pocillo.

La secuenciación de genes aprovecha el hecho de que las dos hebras de una hélice de ADN son complementarias: de las cuatro bases químicas adenina, guanina, timina y citosina, que están unidas en varios órdenes en cada hebra, la adenina se empareja solo con la timina y guanina solo con citosina. En la técnica de secuenciación más utilizada, que se basa en un esquema desarrollado hace 30 años por Frederick Sanger de la Universidad de Cambridge, los fragmentos de ADN se separan en hebras simples y se exponen a nucleótidos libres, que se unen a los As, Cs, Ts, y Gs para generar nuevas hebras complementarias. Estas hebras varían en longitud porque algunos de los nucleótidos libres se han modificado para evitar que continúe la reacción; cuando una de estas bases se une a su objetivo, la cadena deja de crecer. Y cada uno de estos cuatro tipos de terminadores de cadena tiene un fluoróforo diferente adherido que emite fluorescencia cuando es alcanzado por un rayo láser. Una corriente eléctrica separa las hebras por tamaño, y el láser lee los colores para determinar cuál fue la última base agregada a cada cadena, explicando la secuencia. La gran mayoría de los laboratorios que realizan secuenciación hoy en día utilizan una máquina fabricada por Applied Biosystems que escupe alrededor de dos millones de bases al día.

El último secuenciador de 454 puede leer 300 millones al día.

El método 454 evita varios de los pasos de secuenciación convencional que consumen más tiempo, como la separación de hebras por tamaño. A diferencia de la secuenciación de Sanger, no termina cadenas: registra bases a medida que se agregan a una hebra en crecimiento. Primero, una molécula de ADN se corta al azar en diferentes longitudes. Luego, cada fragmento se separa en hebras individuales y cada hebra se une a una pequeña cuenta separada. Un proceso bioquímico copia las hebras simples, de modo que de cada cuenta sobresalen 10 millones de clones. Luego, cada perla se empaqueta en uno de los 1.6 millones de pozos. Como, Cs, Ts y Gs se lavan secuencialmente sobre los pocillos para sintetizar nuevas hebras complementarias.

Aquí está la parte verdaderamente inteligente: utilizando un método descrito por primera vez por Pål Nyrén y sus compañeros de trabajo en el Instituto Real de Tecnología de Suecia, el secuenciador de 454 registra instantáneamente cuándo se agrega una base a cada hebra aprovechando el hecho de que la reacción de unión libera una sustancia química llamada pirofosfato. En los pozos de la máquina 454, el pirofosfato es capturado por una cascada química que termina activando la enzima luciferasa (que ocurre naturalmente en las luciérnagas), emitiendo un estallido de luz. Un dispositivo estándar de carga acoplada del tipo utilizado en cámaras digitales y telescopios detecta cada destello, leyendo la secuencia de As, Cs, Ts y Gs en cada fragmento. El proceso puede leer entre 200 y 300 bases seguidas. Al igual que en la secuenciación convencional, las computadoras luego buscan secuencias coincidentes al final de un fragmento y al comienzo de otro, juntando los fragmentos en el orden correcto.

El secuenciador que 454 sacó al mercado en octubre de 2005 tenía algunas limitaciones importantes. Solo podía leer 100 bases seguidas (cuanto más largo era el tramo de bases en cada fragmento secuenciado, más fácil era ensamblar un genoma completo), y también tenía problemas para mapear con precisión tramos repetitivos, digamos, seis As consecutivos. Pero Rothberg dice que la filosofía de 454 era sacarlo temprano; Consígalo aceptado. La empresa se centró en primer lugar en los primeros usuarios como Broad's Lander, con la esperanza de que pronto publicaran los resultados que se basaban en el secuenciador. Primero tienes que conseguir a los primeros, pero el resto de los muchachos, los seguidores, están donde está el mercado, dice Rothberg. Y leen artículos revisados ​​por pares.

Neandertales
Un artículo de uno de los primeros en adoptar que recibió una amplia atención de los científicos y del público por igual fue un estudio del ADN neandertal dirigido por Svante Pääbo del Instituto Max Planck de Antropología Evolutiva en Leipzig, Alemania. Los neandertales, la especie más cercana a los humanos modernos, desaparecieron hace unos 30.000 años, y más especulaciones que hechos rodean su relación genética con nosotros. Aunque Pääbo había realizado algunos estudios previos con ADN neandertal, cualquier cosa más allá del análisis rudimentario había resultado demasiado difícil y costoso. El problema es que durante miles de años, las pocas muestras conocidas de ADN neandertal de fósiles se han degradado a fragmentos cortos de alrededor de 50 a 75 pares de bases. Además, el ADN a menudo está contaminado con material genético de microorganismos y los humanos modernos que han manipulado los fósiles. Pero Rothberg creía que la máquina 454 podría analizar muchas secuencias cortas a bajo costo, generando suficiente información para permitir que los científicos separaran tesoros antiguos de la basura. Rothberg llamó en frío Pääbo, quien accedió a colaborar.

Después de secuenciar genes de 70 muestras de huesos y dientes de Neandertal, el equipo de Pääbo y los investigadores de 454 encontraron una muestra, estimada en 38.000 años, que tenía en su mayoría ADN limpio. Como informaron en un artículo publicado el otoño pasado en Naturaleza , luego secuenciaron un millón de pares de bases de menos de 200 miligramos de material, un logro que ha arrojado pistas sobre si los humanos modernos y los neandertales se cruzaron y cuándo las dos especies divergieron entre sí. Más importante aún, el artículo muestra que la secuenciación de los tres mil millones de bases en el genoma neandertal es factible. Hacerlo podría ayudar a resolver misterios tales como si los neandertales tenían la capacidad genética para hablar.

Determinar si los humanos y los neandertales se cruzaron o incluso si tenían la capacidad de hablar entre sí puede recibir mucha atención de la prensa y del público, pero otras aplicaciones para la secuenciación ultrarrápida del ADN podrían tener un impacto mucho mayor en la medicina y en nuestras vidas. El método de secuenciación tradicional analiza el ADN de muchas células diferentes. Pero si una de esas células es, digamos, una célula tumoral, su secuencia puede diferir ligeramente de la de las células sanas. En tales casos, las computadoras seleccionan la secuencia que se encuentra con más frecuencia y descartan las demás. En su lugar, los secuenciadores de próxima generación como los comercializados por 454 clonan y secuencian moléculas individuales de ADN, lo que permite un sondeo ultraprofundo que puede descubrir variantes raras. (Los secuenciadores tradicionales también pueden analizar moléculas individuales, pero es prohibitivamente caro). Las implicaciones de la secuenciación de una sola molécula son enormes para la medicina. Si bien no es práctico utilizar la secuenciación convencional para detectar las diferencias de ADN entre las células sanas y enfermas, las nuevas máquinas pueden realizar tales experimentos fácilmente.

Matthew Meyerson, patólogo clínico del Dana-Farber Cancer Institute en Boston, ha publicado un estudio que muestra cómo la máquina 454 puede ayudar a descubrir mutaciones relacionadas con el cáncer de pulmón. Los medicamentos contra el cáncer de pulmón ahora disponibles se dirigen al gen que Meyerson está secuenciando, y espera que los médicos finalmente obtengan un mejor control sobre quién responderá a qué medicamentos al saber si el paciente tiene una mutación en particular. Me imagino que en unos años todos los pacientes con cáncer tendrán sus tumores caracterizados por secuenciación de una sola molécula si la tecnología continúa reduciendo el costo, dice.

En una variación de este tema, Michael Kozal, un clínico de SIDA en Yale, se ha unido a 454 para realizar una secuenciación ultra profunda del VIH para determinar la presencia de poblaciones menores de virus resistentes a los medicamentos. Las primeras pruebas de la técnica en pacientes detectaron aproximadamente el doble de VIH resistente que la secuenciación de Sanger. Esta información también podría ayudar a los médicos a individualizar los regímenes de tratamiento, lo que aumentaría la rentabilidad. Es práctico hacerlo en nuestro sistema, dice el científico jefe de 454 Michael Egholm, que colabora con Kozal. Antes, simplemente no era asequible.

MyGenome
George Church, un pionero de la secuenciación en la Escuela de Medicina de Harvard, dice que el costo es la clave. A medida que sus precios caigan en los próximos años, dice, estas máquinas se convertirán en una fuerza democratizadora que hará que los secuenciadores tradicionales sean casi obsoletos, al igual que las computadoras personales desplazaron a los mainframes. Y esto dará lugar a aplicaciones que nadie puede comprender todavía. Si todavía estuviéramos trabajando con mainframes, no estarían sucediendo muchas cosas interesantes, dice.

Church, que estuvo entre la docena de investigadores que propusieron el Proyecto Genoma Humano a mediados de la década de 1980, es uno de los pocos biólogos cuyo equipo de laboratorio incluye un tornillo de banco montado en una mesa y una prensa taladradora. Utiliza equipos como este para construir sus propios secuenciadores de próxima generación, de los cuales su laboratorio tiene actualmente ocho (ver TR35, septiembre / octubre de 2006) . Convencido de que las empresas están cobrando de más por sus máquinas, se asegura de compartir libremente sus conocimientos con los colegas interesados. Compara su filosofía con la mentalidad wiki y Linux, diciendo: Si un grupo de hormigas se junta, pueden mover una planta de árbol de caucho.

La gran visión de Church es canalizar la corriente barata de A, C, Ts y G en lo que él llama el Proyecto Genoma Personal. En el Proyecto Genoma Humano, los investigadores obtuvieron ADN de varias personas, cada una de las cuales, por razones de privacidad, permanece en el anonimato. Entonces, la secuencia final representa una persona compuesta con un conglomerado de diferentes antecedentes genéticos e historiales médicos. Church quiere que su Proyecto Genoma Personal decodifique el ADN de las personas, que también ofrecerán voluntariamente sus registros médicos. Publicará todos los datos resultantes en Internet. En última instancia, imagina, millones de personas se unirán al proyecto, publicando sus secuencias, registros médicos y, si así lo desean, incluso fotografías faciales en línea. Entonces, el mundo entero tendrá acceso a todos los datos que necesita para probar hipótesis libremente.

Aunque Church ha recibido fondos sustanciales de los Institutos Nacionales de Salud para desarrollar tecnología de secuenciación, las cuestiones éticas, legales y sociales planteadas por el Proyecto Genoma personal han impedido que los NIH lo respalden, a pesar de una revisión positiva de una solicitud de subvención en agosto de 2005. Tan pronto como obtuve la aprobación, los NIH se emocionaron, y no necesariamente en el buen sentido, dice. Ha intentado abordar los problemas de privacidad y confidencialidad, señalando que la identidad de nadie debe hacerse pública y que los NIH ya financian proyectos de genética humana que tienen menos salvaguardias.

Church reconoce que el conocimiento íntimo de su propio ADN puede ser demasiado para muchas personas. No permite que sus hijos naveguen por sitios de pornografía en Internet, dice, y hasta cierto punto, no se permite navegar por los sitios más asquerosos y aterradores. Él espera que en lugar de acceder a sus genomas sin procesar, las personas tengan profesionales que los ayuden a interpretar la información.

A pesar de la falta de financiación federal y las objeciones éticas, Church sigue adelante, confiado en que los avances en la tecnología de secuenciación impulsarán la idea de un Proyecto Genoma Personal, al igual que los avances en la tecnología de la información han llevado a extraños a compartir datos de formas que nadie soñó. de cuando el Apple II de doble unidad de disquete debutó hace 30 años. A medida que los secuenciadores se vuelven más eficientes, cree, y los costos continúan bajando, la genómica personal despegará en una escala que pocas personas han imaginado todavía.

Ganar la loteria
En octubre pasado, la X Prize Foundation anunció un premio de $ 10 millones por producir secuencias altamente precisas de 100 genomas humanos en 10 días o menos sin gastar más de $ 10,000 por genoma. Uno de los primeros participantes fue 454, que planea desarrollar perlas aún más pequeñas que espera permitan a sus máquinas leer aún más ADN por ejecución a aproximadamente el mismo costo. No necesitamos ninguna física o matemática nueva para llegar al genoma de $ 1,000, dice Rothberg.

Dejando a un lado la pregunta de cuándo, o si alguien reclamará el Premio X, la secuenciación de ADN seguramente seguirá cayendo en picado y aumentando en precisión. Hasta el año pasado, la secuenciación realmente luchaba por tener el impacto en la próxima era de la genómica que debía tener, dice David Bentley, científico jefe de Illumina. Básicamente, el precio de la secuenciación tradicional simplemente no bajaba lo suficientemente rápido. Ahora el campo es mucho más optimista de lo que era, dice. La secuenciación de próxima generación tiene un papel muy importante que desempeñar.

Escuchar a los científicos marcar las posibilidades es como escuchar a los ganadores de la lotería. Y la medicina personalizada como el tipo de prueba y tratamiento del cáncer que Meyerson de Dana-Farber espera ayudar a introducir es solo un punto de partida. Bentley dice que los nuevos secuenciadores abrirán ventanas a las vastas regiones no codificantes del genoma que activan y desactivan los genes. Egholm de 454 señala que el Proyecto Genoma Humano en realidad no secuenció hasta el último fragmento de ADN humano; Es posible que todavía queden genes sin descubrir que se puedan encontrar mediante secuenciación adicional. Broad's Lander imagina un torrente de nueva información sobre lo que lleva a una célula a diferenciarse en un tipo u otro (un misterio central en la biología del desarrollo) y qué controla los diferentes estados celulares. Me doy cuenta de que es más difícil de explicar que curar el cáncer, dice, pero en última instancia es más importante porque afectará a todas las enfermedades.

Lander predice que dentro del próximo año, los científicos podrán comenzar estudios que generen terabases de información: un billón de As, Cs, Ts y Gs. Ni siquiera dije la palabra terabase antes del año pasado, dice. Y si todos esos datos están en la Web y están disponibles gratuitamente, impulsará un tipo de biología completamente diferente.

Jon Cohen, escritor independiente y corresponsal de San Diego Ciencias , está trabajando en un libro que analiza las diferencias genéticas que separan a los chimpancés de los humanos.

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