Secuenciación de una sola molécula de ADN

En la esquina de las oficinas de Helicos BioSciences en Cambridge, MA, una pantalla en la cara de lo que parece un refrigerador gigante muestra una cuenta regresiva: 10 días, cinco horas y 51 minutos hasta que termina de leer la secuencia de todo el ADN que tiene. ha sido alimentado en él. La máquina de alto rendimiento, una configuración compleja de tubos, láseres y productos químicos, contiene dos placas, cada una con 25 canales de microfluidos grabados en ella. Cada canal es capaz de contener y secuenciar una muestra de ADN separada. Al secuenciar las muestras en paralelo, la máquina tarda solo una hora en leer 1.300 millones de las bases químicas, conocidas como A, C, T y G, que forman una hebra de ADN.

El HeliScope es la primera máquina comercial que secuencia una sola pieza de ADN en lugar de una copia muchas veces. Cada celda de flujo (arriba) tiene 25 canales, cada uno capaz de contener 16 millones de hebras de ADN para secuenciar. Un revestimiento en la superficie de la celda permite que se lave limpia entre reacciones.

Llamado HeliScope, es el primer instrumento comercial que puede leer directamente la secuencia de una sola hebra, una capacidad que le da el potencial de una velocidad sin precedentes. De hecho, dice Stephen Quake, un bioingeniero de la Universidad de Stanford que cofundó la empresa en 2003, Helicos básicamente ha construido el secuenciador de ADN más rápido del mundo. Aunque no está claro si la máquina producirá una secuencia completa más rápidamente que los sistemas de la competencia (los datos generados por una máquina de secuenciación aún deben analizarse y unirse, una tarea computacionalmente intensiva), Quake dice que está abriendo áreas completamente nuevas de investigar.

Esta historia fue parte de nuestro número de julio de 2008

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El HeliScope, presentado a principios de este año, se une a una intensa carrera por tecnologías de secuenciación más rápidas y económicas. El precio de secuenciar un genoma humano se ha reducido en los últimos años, de los 300 millones de dólares que gastó el Proyecto Genoma Humano en su primer borrador a menos de 100.000 dólares. Las aplicaciones de la secuenciación barata son casi ilimitadas, desde el diagnóstico de enfermedades hasta la investigación que podría producir microbios diseñados para producir biocombustibles o medicamentos.

En otras tecnologías de secuenciación avanzadas actualmente en uso, incluidas las de Illumina, Applied Biosystems y 454 Life Sciences (que fue adquirida por Roche el año pasado), el ADN que se secuenciará debe amplificarse o copiarse muchas veces; Luego, las copias se leen simultáneamente para facilitar la detección de señales fluorescentes que indican la posición de cada letra de ADN. La secuenciación de una sola molécula omite el paso de copia, lo que significa que se pueden empaquetar muchas más muestras únicas en un solo experimento de secuenciación.

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• Vea el proceso de Helicos Biosciences para secuenciar una sola molécula de ADN.

• Stephen Quake, cofundador de Helicos Biosciences, habla sobre la secuenciación.

Además, la secuenciación de una sola molécula puede generar una imagen más completa del genoma. Esto se debe a que cuando se amplifica el ADN, es más probable que algunas cadenas se copien con éxito que otras, por lo que es más probable que estén representadas en la secuencia final. Del mismo modo, es posible que las mutaciones genéticas raras no estén representadas porque no se copian. Si al final del día puede poner una sola hebra de ADN en una plataforma y secuenciarla directamente, es una gran ventaja, dice Elaine R. Mardis, codirectora del Centro de Genoma de la Universidad de Washington en St. Louis.

Despierto en la noche
Con la tecnología Helicos, el ADN que se va a secuenciar se corta primero en trozos cortos de unas 200 bases de largo y se inyecta en una celda de flujo, un portaobjetos de vidrio especializado. La celda de flujo está cubierta con pequeños fragmentos de ADN que están diseñados para enganchar los fragmentos mientras flotan, anclándolos en su lugar. Las piezas de ADN inmovilizadas se etiquetan con fluorescencia para que una cámara pueda registrar su posición bajo un microscopio de fluorescencia. Se pueden analizar casi mil millones de piezas de ADN en un solo experimento de secuenciación, en comparación con alrededor de 400.000 a 50 millones para otras tecnologías.

Luego, la celda de flujo se coloca en el HeliScope, donde el microscopio se encuentra instalado en 400 libras de granito de Vermont. El peso adicional evita que las vibraciones interfieran con las señales que el dispositivo debe detectar. Un complejo sistema óptico y una maraña de tubos rodean el microscopio y lo conectan a lo que parece una nevera en miniatura llena de botellas de productos químicos especialmente fabricados.

Cuando un científico activa la máquina, comienza una danza de fluidos coreografiada con precisión. Una enzima llamada ADN polimerasa y un solo tipo de base marcada con fluorescencia, por ejemplo, A, fluyen hacia la célula. La enzima hace que los A ocupen su lugar en hebras de ADN en crecimiento que complementan las hebras de las muestras. (Cada una de las cuatro bases puede emparejarse solo con otra base, por lo que una A adicional debe alinearse frente a una T existente y una C contra una G.) Una vez que la base etiquetada con fluorescencia se incorpora a la nueva hebra, la cámara del HeliScope puede detecta la luz que emite. El generador de imágenes detecta una pluma, un cono de luz de 200 nanómetros, a partir de la integración de una sola [base] en una sola hebra de ADN, dice Steve Lombardi, presidente de Helicos.

Otros métodos de secuenciación avanzados utilizan un enfoque similar, conocido como secuenciación por síntesis. Pero a diferencia de esas tecnologías, el HeliScope puede distinguir la señal fluorescente no amplificada de una sola base que ocupa su lugar en una cadena de ADN en crecimiento. Una clave de esa capacidad es un material antiadherente que desarrolló la empresa, que recubre la superficie de la celda de flujo y permite que se lave limpia entre reacciones: las bases fluorescentes residuales dificultarían la detección precisa de reacciones de secuenciación individuales. Debe asegurarse de que no se adhieran moléculas de base adicionales a la superficie, dice Patrice Milos, director científico de Helicos. Este fue uno de los mayores desafíos iniciales. Después de cada ciclo, los marcadores fluorescentes se recortan de las bases recién incorporadas y los productos químicos restantes se eliminan por lavado. El proceso se repite secuencialmente con cada una de las cuatro bases.

HeliScope genera una gran cantidad de datos brutos cada segundo. Se necesitan de cinco a diez días para leer todo el ADN que se puede cargar en dos celdas de flujo; para la secuenciación, son 400 millones de hebras de ADN por célula, lo que puede generar 20 mil millones de bases de secuencia utilizable. Los científicos cargan la máquina, presionan un botón en su cara y se van. Pero los obsesionados con la secuenciación pueden usar Internet para verificar el progreso de la máquina en medio de la noche, algo común en Helicos.

Una vez que HeliScope crea su serie de fotografías de fluorescencia, un centro de procesamiento de datos adjunto las convierte en cadenas de letras. El software pega estas piezas para formar una secuencia más larga.

Mutaciones faltantes
En un artículo publicado en Ciencias A principios de este año, los científicos informaron sobre el uso del HeliScope para secuenciar el genoma del virus M13, prueba importante de que la secuenciación de una sola molécula podría usarse para leer y ensamblar la secuencia de un genoma completo. (Aproximadamente 7.000 pares de bases de largo, el genoma del virus M13 es pequeño, alrededor de una millonésima parte del tamaño de un humano). La tecnología es tan nueva que aún no está claro para qué aplicaciones se adaptará mejor. Pero algunos científicos creen que la secuenciación de una sola molécula podría ser particularmente importante para comprender cómo las variaciones genéticas contribuyen a la enfermedad. Después de todo, es posible que algunas mutaciones raras relacionadas con la enfermedad se hayan pasado por alto en estudios genómicos anteriores porque no se copiaron durante el proceso de amplificación.

Helicos todavía está jugando con la tecnología, desarrollando una química que podría aumentar la velocidad de las reacciones de secuenciación y permitir que más piezas de ADN se anclen a una celda de flujo. Junto con los otros actores importantes en el campo, la compañía espera entregar una secuencia completa del genoma por $ 1,000, un logro que marcaría el comienzo de algo totalmente nuevo en la medicina: la capacidad de los individuos para acceder a su propia información genómica.

Emily Singer es NIÑOS Editor de biotecnología y ciencias de la vida.

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