ARN recetado

Es champán para todos. Phil Zamore saca el corcho de una botella de Montaudon, empapando la alfombra nueva. Todos en su laboratorio llenan un vaso para brindar por el jefe. Buenas noticias inesperadas, explica. Zamore, bioquímico de la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts en Worcester, acaba de recibir un premio nacional por valor de 1 millón de dólares durante cinco años. El presupuesto del laboratorio simplemente se triplicó.

Es comprensible que Zamore esté mareado, y no se trata solo de dinero. El campo de Zamore, la interferencia de ARN o ARNi, tiene solo unos pocos años, pero ha revolucionado el mundo de la biología. El ARNi es la información más interesante en biología en las últimas décadas o dos, dice el premio Nobel Phillip Sharp, biólogo del MIT. Y el laboratorio de Zamore es uno de los pocos que hacen avanzar el campo a un ritmo vertiginoso. Creo que todos los que trabajan en el campo se sienten un poco sin aliento por el progreso, dice Zamore.

Esta historia fue parte de nuestro número de diciembre de 2002

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La sensación de entusiasmo que comparten Zamore, Sharp y otros investigadores está bien fundada. Durante décadas, los investigadores pensaron que el ARN era simplemente el mensajero del ADN, que entregaba servilmente los planos de las proteínas del ADN. Pero ahora parece que pequeñas cadenas dobles de ARN, introducidas en células o animales cultivados en laboratorio, pueden desactivar de manera rápida y eficiente cualquier gen dado.

Las implicaciones son impresionantes, porque los organismos vivos se definen en gran medida por el encendido y apagado de los genes, exquisitamente orquestado. Los biólogos, hasta ahora, solo han podido imitar este proceso de cambio de una manera lenta, pesada e indirecta. Pero la facilidad con la que el ARNi puede desactivar los genes, dicen los investigadores, parece casi mística. Las técnicas de laboratorio que utilizan RNAi ya son métodos de elección de los biólogos para descubrir las funciones de genes particulares. Y promete una nueva forma de tratar la enfermedad directamente mediante la desactivación de genes clave implicados en diversas dolencias. Ya, al menos ocho empresas, incluida una fundada por Zamore, Sharp y sus colegas, ya están trabajando en terapias de ARNi para todo, desde enfermedades virales hasta cáncer.

El Santo Grial es convertir todo esto en drogas, dice Zamore. Para poder darle un pequeño ARN de interferencia que apagaría la expresión de su gen de colesterol alto. Eso reduciría el nivel de hepatitis C que infecta su hígado. O tal vez, creo que quizás en la aplicación más grande del mundo, que se enfocaría en un gen específico de las células tumorales y mataría el tumor.

Nadie sabe qué tan pronto podría suceder esto. La interferencia del ARN irrumpió en la conciencia del mundo científico en la reunión anual de la Sociedad de ARN en Banff, Alberta, en mayo de 2001. Allí, Sayda Elbashir, una postdoctora en el laboratorio del bioquímico Thomas Tuschl en el Instituto Max Planck de Química Biofísica en Gttingen, Alemania, sorprendió a sus oyentes con la noticia de que pequeños fragmentos de ARN bicatenario desactivan rápida, fácil y específicamente los genes en las células humanas, un papel que los investigadores nunca antes habían visto desempeñar el ARN.

La mayoría de la audiencia estaba sentada y se decía a sí misma: La ciencia acaba de cambiar ”, recuerda el bioquímico de la Universidad de Michigan, David Engelke. Lo único que evitó el caos fue que nos habían prometido este tipo de cosas antes. Escéptico, Engelke esperó unos meses. Entonces estos informes empezaron a llegar: ¡Vaya, esto realmente funciona! '

La sorpresa del ARN

Hasta hace poco, el papel poco glamoroso que los biólogos habían atribuido al ARN era el de mensajero pasivo, que entrega información genética del ADN a la maquinaria de producción de proteínas de la célula. En este proceso, el código de ADN de un gen se transcribe en una copia de ARN, que la maquinaria celular traduce en una proteína. En la interferencia de ARN, pequeños bits de ARN bloquean el proceso al destruir el mensaje en ruta. Los fragmentos de ARN de doble hebra conducen a las enzimas de corte al ARN que transmite el mensaje genético. Luego, el ARN mensajero se corta y se marca para su destrucción: el mensaje del gen se silencia de manera efectiva.

Los biólogos han sabido durante años que las moléculas de ARN monocatenario diseñadas para emparejarse con un ARN mensajero podrían detener la producción de proteínas, pero este proceso artificial no es confiable ni siquiera en el laboratorio. La naturaleza, sin embargo, regula los genes usando ARN, específicamente moléculas de doble hebra.

Los primeros indicios del fenómeno aparecieron en 1990, pero en ese momento, los investigadores no conectaron lo que habían observado con el ARN. Ese año, el biólogo de plantas Rich Jorgensen, entonces en DNA Plant Technology en Oakland, CA, estaba tratando de hacer que las petunias púrpuras tuvieran un tono más profundo de púrpura. Insertó una nueva copia supercargada del gen que controla la producción de pigmento púrpura. Para su sorpresa, consiguió petunias blancas. Jorgensen reconoció la importancia de este efecto paradójico, pero no pudo explicar por qué la adición de más de un gen había desactivado ese gen.

La siguiente pista llegó en 1995, cuando los genetistas de la Universidad de Cornell clonaron un gen en el gusano microscópico del suelo. C. elegans . Para verificar su descubrimiento, utilizaron un método de laboratorio estándar para desactivar el gen: agregaron una sola hebra de ARN que coincidía con el ARN mensajero. Esta hebra complementaria se unió al mensajero, impidiendo que se tradujera en una proteína. Inesperadamente, una hebra única no complementaria de ARN que estaban usando como control experimental y que no debería haber hecho nada, también apagó el gen.

En 1998, el bioquímico Andrew Fire, entonces de la Carnegie Institution de Washington, y el genetista Craig Mello, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, resolvieron el misterio. Al inyectar hebras simples complementarias de ARN en gusanos, obtuvieron un efecto silenciador asombrosamente potente cuando las dos hebras se combinaron. Después de demostrar que el ARN bicatenario era el verdadero agente silenciador, Fire y Mello acuñaron el término interferencia de ARN y nació un nuevo campo. En retrospectiva, los genes púrpuras sobrealimentados de Jorgensen produjeron ARN de doble hebra que tuvieron el mismo efecto en los genes púrpuras nativos, esencialmente desactivándolos.

El ARN de doble hebra parecía proporcionar un medio más estable y confiable para apagar genes específicos que las hebras simples, y los laboratorios que estaban estudiando organismos, incluidas plantas, gusanos y moscas, adoptaron con entusiasmo el nuevo método. Sin embargo, la interferencia del ARN no funcionó en los mamíferos: el sistema inmunológico destruye las células que contienen ARN de doble hebra para defenderse de los virus de ARN como los que causan la hepatitis A y C. Luego, Tuschl y Elbashir revelaron en Banff que los segmentos de ARN muy cortos, que denominaron ARN interferente pequeño, funcionó en células humanas. En ese momento, dice Sharp, todo el campo despegó.

Tratamiento silencioso

Ahora los investigadores están buscando formas de convertir este nuevo y poderoso rol del ARN en ganancias corporativas. Prácticamente todas las compañías farmacéuticas ya utilizan la interferencia de ARN como herramienta para el descubrimiento de fármacos. Una de las estrategias más populares para encontrar nuevos objetivos farmacológicos consiste en anular o inhabilitar genes uno por uno para ver qué sucede. Si, por ejemplo, un animal enfermo puede curarse mediante la desactivación de un gen en particular, la proteína de ese gen podría ser un buen objetivo para el fármaco. Resulta que el uso de pequeños ARN interferentes puede acelerar radicalmente este proceso. En lugar de pasar meses o años para diseñar un knockout, los investigadores usan los ARN para apagar específica y rápidamente un gen. También pueden observar si la desactivación de la proteína, como lo haría un medicamento, provoca efectos secundarios. El proceso se lleva a cabo en cuestión de días, en lugar de un año, dice Christophe Echeverri, director ejecutivo de Cenix BioScience, una empresa de biotecnología en Dresde, Alemania.

En la aplicación final, los pequeños ARN interferentes podrían ser en sí mismos medicamentos: en lugar de bloquear una proteína en particular, como lo hacen los medicamentos estándar, el ARNi evitaría que se produzca la proteína. En junio pasado, Sharp del MIT demostró que tales ARN, dirigidos a genes virales y humanos clave, podrían detener la infección por VIH en células cultivadas en el laboratorio. En un experimento, los investigadores mezclaron células infectadas por el VIH con pequeños ARN interferentes dirigidos a genes virales. Los ARN detuvieron la reproducción viral. El grupo de Sharp también mezcló células no infectadas con pequeños ARN interferentes dirigidos a CD4, una proteína en la superficie de las células a través de la cual el VIH ingresa. Los investigadores demostraron que los ARN disminuían la producción de CD4. Dos días y medio después, expusieron al VIH las células tratadas con ARN y las células no tratadas. El virus infectó cuatro veces más células no tratadas.

A pesar de los resultados alentadores, por el momento, los fármacos ARNi todavía se encuentran en la etapa del sueño, dice Sharp. Pero Sharp consideró la promesa inicial lo suficientemente tentadora como para cofundar, con Zamore, Tuschl y otros dos científicos, Alnylam Pharmaceuticals en Cambridge, MA, para desarrollar tales fármacos. La compañía apenas había despegado cuando obtuvo $ 17 millones en fondos de capital de riesgo en julio pasado.

Sin embargo, fabricar fármacos ARNi no será fácil. Por un lado, nadie ha encontrado métodos adecuados para administrar los ARN a humanos. Hay un problema de entrega. Es tan simple como eso, dice Stuart Schreiber, químico de la Universidad de Harvard. Llevar ácidos nucleicos a sus tejidos diana [es] un problema no resuelto en medicina. La terapia de ARNi es esencialmente terapia génica, dice Schreiber, y enfrentará los mismos problemas (ineficiencia, ineficacia y efectos secundarios inmunológicos) que han estancado ese campo desde 1999, cuando Jesse Gelsinger murió durante un ensayo de terapia génica en la Universidad de Pensilvania. Allí, los médicos utilizaron virus modificados como vehículos de distribución, o vectores, para transportar el ADN a las células del adolescente. El sistema inmunológico de Gelsinger respondió de manera masiva y fatal.

Sharp dice que la esperanza es que el ARN interferente pequeño podría no necesitar vectores para alcanzar su objetivo, evitando así la mayoría de las trampas asociadas con la terapia génica basada en ADN. Pero ese escenario está lejos de ser seguro. ¿Se pueden modificar los ARN para hacerlos más estables [y] para que las células los absorban de manera más eficiente? Pregunta Sharp. No lo sabemos.

Tener sentido

La historia biomédica reciente no ayuda a resolver la incertidumbre. De hecho, esta no es la primera vez que los científicos intentan fabricar un fármaco basado en silenciar el ARN. El ARN o ADN monocatenario antisentido también puede desactivar genes y no necesita un vector. Dentro de la célula, una molécula antisentido encuentra su ARN mensajero complementario y, como dos lados de una cremallera, se unen fuertemente, evitando que el ARN mensajero pase a través de la maquinaria de producción de proteínas de la célula. El resultado, al menos en teoría, es la desactivación de genes.

Sin embargo, el antisentido ha sido hasta ahora una decepción como base para nuevos fármacos. Después de más de una década de intenso trabajo de desarrollo, solo un fármaco antisentido, Vitravene de Isis Pharmaceuticals, para el tratamiento de ciertas infecciones oculares raras en pacientes con sida, ha obtenido la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos. La primera generación de medicamentos antisentido, que se probaron a principios de la década de 1990, se degradaron rápidamente en el cuerpo, eran difíciles de ingresar en las células, a menudo no lograban encontrar su objetivo y causaban efectos secundarios graves. Actualmente se están probando en seres humanos fármacos antisentido más estables.

¿Puede el ARNi hacerlo mejor que el antisentido? No en el corto plazo, predice Frank Bennett, vicepresidente de investigación antisentido de Isis. Si compara RNAi con la versión actual de antisentido, realmente no hay ninguna ventaja, dice. La tecnología del ARN [de pequeña interferencia] está realmente en su infancia. Es algo equivalente a donde estaba el antisentido hace 10 años, cuando recién comenzábamos a hacer experimentos con animales.

Pero la gente de RNAi considera que su tecnología es fundamentalmente diferente de la antisentido. La gran ventaja aquí de RNAi sobre el antisentido es que, he aquí, esto realmente funciona, dice el CEO de Cenix, Echeverri. El ARNi, dice, es mucho más potente y confiable que el antisentido. Los proyectos antisentido se veían típicamente como proyectos suicidas, dice. Podrías dedicar mucho tiempo a hacerlo funcionar y nunca funcionaría. Te quedarías sin nada que mostrar. Echeverri cree que la mayor potencia del ARNi debería producir mejores terapias. Y como se necesitará menos fármaco para silenciar un gen, debería haber menos efectos secundarios.

La gente ha estado luchando con el antisentido, y aquí viene una tecnología que realmente funciona, concuerda Jon Wolff, director científico de Mirus, una compañía de terapias de ARN en Madison, WI. El antisentido es difícil de reproducir, pero el ARNi es algo que funciona de inmediato.

Pero, ¿podría RNAi ser simplemente otra tecnología sobrevalorada? La prueba está en el pudín, dice Echeverri. Durante los últimos dos o tres años, RNAi se ha hecho cargo por completo. Todo el mundo está recurriendo a él; en cada organismo lo están probando. Y no sería tan popular si no tuviera éxito.

Silenciar dudas

Nadie ha probado aún RNAi en humanos, pero una empresa está cerca: Ribopharma, una empresa de biotecnología en Kulmbach, Alemania. Más de un año antes de que el grupo de Tuschl sorprendiera a la comunidad científica con su noticia, los fundadores de Ribopharma, los ex profesores de la Universidad de Bayreuth Roland Kreutzer y Stefan Limmer, descubrieron que los ARN pequeños funcionaban en células de mamíferos. O eso afirman Kreutzer y Limmer. Nunca han publicado sus datos.

Kreutzer y Limmer razonaron que era físicamente imposible que los ARN muy largos, como los utilizados por Fire y Mello, se unieran todos a la vez a sus ARN objetivo. Solo se mantendrían los segmentos cortos. Así que intentaron silenciar los genes de los mamíferos utilizando ARN lo suficientemente cortos como para evadir la respuesta inmune fatal. Era un juego, dice Limmer. Y resultó que realmente funciona. Los investigadores presentaron una solicitud de patente, renunciaron a sus trabajos docentes y en junio de 2000 fundaron Ribopharma.

Los directores de Ribopharma planean comenzar los ensayos en humanos el próximo año, probablemente comenzando con pruebas de pequeños ARN interferentes en el tratamiento del melanoma maligno y el cáncer de páncreas. Kreutzer y Limmer dicen que sus construcciones de ARN son lo suficientemente estables como para funcionar sin vectores y pueden inyectarse directamente en el sitio de un tumor o en el torrente sanguíneo. La compañía ha recaudado más de $ 18 millones. Pero debido a que Ribopharma aún no ha publicado sus resultados, es difícil evaluar sus afirmaciones, dicen otros investigadores de ARN. Han estado haciendo algunas cosas, dice Sharp del MIT, bastante bien ... [Pero] es un largo camino.

¿Cuánto tiempo? Las actitudes van desde las optimistas garantías de Ribopharma hasta un fuerte pesimismo. David Beach, presidente de la startup RNAi Genetica en Cambridge, MA, señala la odisea de más de una década de antisense. No quiero sentarme y discutir que la implementación de RNAi en un modo terapéutico sería más simple, dice.

Lo que está mucho más claro es que el ARNi está obligando a los biólogos a repensar el papel del ARN. En los últimos años, los investigadores han encontrado cientos de genes que codifican pequeñas moléculas de ARN, denominadas microARN, en organismos que van desde plantas y gusanos hasta humanos. Al igual que sus pequeños primos ARN interferentes, los microARN parecen silenciar genes, pero su papel en biología es mayormente desconocido. Muchos de ellos se han conservado en gran medida durante el curso de la evolución; [entonces] deben estar haciendo algo importante, dice el biólogo del MIT David Bartel. Mientras tanto, la comprensión de que el ARNi es un proceso natural y probablemente fundamental en plantas y animales ha contribuido a convertirlo en uno de los misterios más emocionantes de la biología actual.

Los diminutos genes de ARN pueden ser el equivalente biológico de la materia oscura, a nuestro alrededor, pero casi escapando a la detección, escribió Gary Ruvkun, biólogo molecular de la Escuela de Medicina de Harvard, en 2001 en la revista. Ciencias . ¿Qué están haciendo estos misteriosos genes? Sospecho que lo que estamos viendo es un método muy antiguo para controlar la expresión genética, dice Zamore.

Si los microARN son interruptores que deciden si las células madre se convierten en neuronas o músculos, o si las células cancerosas crecen o mueren, entonces la interferencia del ARN es mucho más importante de lo que nadie imaginaba hace unos años. Simplemente nos topamos con una rama completamente nueva de la biología molecular que no conocíamos antes, dice Engelke de Michigan.

Para los optimistas, estos avances presagian el rápido desarrollo de fármacos eficaces. E incluso los investigadores biomédicos que se han vuelto cínicos por afirmaciones extravagantes de curas mágicas piensan que el ARNi puede ser real. El año pasado, cuando el ARNi funcionó por primera vez en células humanas, todos se despertaron y dijeron: 'Me pregunto si esta es la solución milagrosa', dice Engelke. Y podría serlo. Puede ser.

Empresas que desarrollan interferencias de ARN EMPRESA ENFOQUE PRIMARIO DE ARNi Productos farmacéuticos de Alnylam
(Cambridge, MA)
Terapéutica Benitec
(Brisbane, Australia)
Propiedad intelectual para genómica y terapéutica Cenix BioScience
(Dresde, Alemania)
Identificación de fármacos diana y terapéutica para el cáncer Devgen
(Gante, Bélgica) Identificación de fármacos objetivo y terapéutica para la diabetes, la depresión y la enfermedad de Parkinson Genetica
(Cambridge, MA)
Identificación de fármacos diana para el cáncer Mirus
(Madison, WI)
Terapéutica, utilizando ARN largo de doble hebra. ribofarma
(Kulmbach, Alemania) Terapias para el cáncer y la hepatitis C

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